Nukleiinihapposynteesin periaatteet

Nukleiinihapposynteesi suoritetaan käyttämällä kiinteän faasin siaaliamiditriglyseridimenetelmää, jolloin DNA:n 3'-pää immobilisoidaan kiinteän faasin substraatille ja nukleotideja lisätään 3'-5'-suunnassa, kunnes haluttu DNA-fragmentti on syntetisoitu. .Tämä eroaa DNA-synteesistä DNA-polymeraasin sovelluksella.

Ensimmäisen emäksen 3'-pää immobilisoidaan CPG:hen synteesin aikana, seuraavan emäksen 5'-OH suojataan di-p-tolyylitrityyli-DMT:llä, emäksen aminoryhmä suojataan bentsoehapolla ja 3'-pää Sitten -OH aktivoidaan aminofosfaattiyhdisteellä.1 emäs 1 emäksen 5 5'-OH:sta ja seuraavan emäksen 3'-OH muodostavat fosfiittitriglyseridin, joka sitten hapetetaan jodilla fosfaattitriglyseridiksi, toisen emäksen 5'-OH suojaaine poistetaan dikloorietikkahapon lisääminen DM kiertää seuraavan emäksen lisäämisen kautta ja synteesin jälkeen 5'-OH:n suoja-aine poistetaan heikolla hapolla. Fragmentti irrotetaan kiinteästä hartsista väkevällä ammoniumhydroksidilla, suojaaine poistetaan emäksestä väkevällä ammoniumhydroksidilla kuumentaen, ammoniumhydroksidi poistetaan, fragmentti kuivataan tyhjiössä ja nukleiinihappo puhdistetaan nestekromatografialla tai PAGE:lla.

Oligosynteesin vaiheet

Poistaminen

The5-pään DMT-suojaryhmä poistetaan lisäämällä TCA-liuosta.

Aktivointi

Aktivaattorin sekoittaminen oligonukleotidimonomeerin kanssa aktiivisen oligonukleotidimonomeerivälituotteen muodostamiseksi.

Kytkentä

5-terminaalinen hydroksyyliryhmä reagoi aktiivisen oligonukleotidivälituotteen kanssa antigeneratiivisessa kondensaatioreaktiossa muodostaen epästabiilin fosfiittitriglyseridisidoksen.

Rajoitus 

Suljettavan aineen lisääminen suorittaa asetylointireaktion ylimääräisillä hydroksyyliryhmillä, jotka eivät osallistu kondensaatioreaktioon.

Hapetus 

Vettä sisältävän jodiliuoksen lisäys reagoi epästabiilien fosfiittisidosten kanssa hapettumalla muodostaen stabiileja fosforihappotriglyseridisidoksia.

Syanoetyylipilkkominen

Nukleiinihappotuote synteesin jälkeen, johon on lisätty DEA-liuosta syanoetyyliryhmän poistamiseksi fosfaattitriglyseridisidoksesta.

Cleaved & Deprotection

Nukleiinihappofragmentit irrotetaan kiinteän faasin kantajasta lisäämällä väkevää ammoniumhydroksidiliuosta ja sitten kuumennetaan suojaavien ryhmien poistamiseksi emästen vetysidoksista.